解剖顯微鏡下印跡試驗(yàn)結(jié)果光密度法定量分析法

Western印跡試驗(yàn)：40只小鼠（每次n=10），用異氟烷深度麻醉，迅速除去頭部。用10ml注射器吸出脊髓。在解剖顯微鏡下，用精細(xì)鉗沿正中溝將 4/5腰椎左右側(cè)分離。以組織蛋白提取液分別注入每側(cè)脊髓液，以聲裂法混勻,顯微鏡價(jià)格，在48C下13000rpm離心5分鐘。Bio-Rad蛋白分析系統(tǒng)測定上清液。加入標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（2%十二烷基硫酸鈉(SDS)，10%丙三醇,體視顯微鏡，0.1%嗅酚藍(lán)，2% 2-巰基乙醇，50 mmol/L Tris-鹽酸 pH=7.2）稀釋樣本。將脊髓突觸素進(jìn)行10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）120V 90分鐘。之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜（Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜，0.45mM孔徑），48C，90V進(jìn)行60分鐘。該膜用5% 脫脂奶粉封閉于帶緩沖鹽溶液的Tween-20中（TTBS，0.1% Tween-20, 20mM Tris-鹽酸 137mM NaCl, pH 7.4），在48C下保存過夜。在室溫下，將PVDF膜與兔的脊髓素特異性多克隆抗體(1:2000)，和鼠的a-微管蛋白特異性單克隆抗體 (1:500)培養(yǎng)三小時(shí)。用TTBS清洗印跡并和辣根過氧化物酶結(jié)合二次抗體(1:3000)室溫培養(yǎng)一小時(shí)。每份樣本都進(jìn)行彩色分子量標(biāo)準(zhǔn)參照。 Western印跡試驗(yàn)結(jié)果用光密度法定量分析。

相差顯微鏡觀測熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞三維培養(yǎng)