用熒光顯微鏡細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子濃度測量 

要用一個(gè)線粒體特異性的探針或者線粒體特異性定位的蛋白做免疫熒光以標(biāo)記線粒體的位置，再以一種不同顏色的二抗標(biāo)記目的蛋白，較后觀察兩種熒光的疊加情況。如果需要更精確的可以分離線粒體后用western blot檢測。如果想用形態(tài)學(xué)方法建議共聚焦或者免疫電鏡，選一種吧，但是看過很多線粒體的文章，用共聚焦的更多，不過需要根據(jù)的實(shí)際情況吧，免疫電鏡也是認(rèn)可的。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，調(diào)控著許多重要的生理活動。從六十年代開始，一些研究小組就已經(jīng)開始合成各種熒光劑進(jìn)行定量檢測Ca2+濃度，目前常用的熒光劑有第二代的fura-2, indo-1, rhod-2以及第三代的Fluo-3, Fluo-4, Fluo-5系列、Calcium Green等。

計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的公式根據(jù)不同熒光劑分兩種情況。
第一種是單激發(fā)熒光劑（如Fluo-3）
[Ca2+]=Kd[F-Fmin]/[Fmax-F]
其中，Kd為熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數(shù)。Fmin是熒光劑沒有結(jié)合Ca2+時(shí)熒光較小值；Fmax是熒光劑被Ca2+飽和時(shí)的熒光較大值。

第二種是雙激發(fā)熒光劑（如fura-2）
[Ca2+]=Kd[R-Rmin]/[Rmax-R]
其中R=F1/F2, F1為激發(fā)波長1的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)2為激發(fā)波長2的熒光強(qiáng)度。Rmin是Ca2+濃度為零時(shí)，熒光較小比值，Rmax為飽和濃度的熒光較大比值。

熒光強(qiáng)度測量方法可以用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和近幾年興起的雙光子熒光顯微鏡。熒光顯微鏡一般采用氙燈、汞燈等光源；共聚焦顯微鏡采用激光為激發(fā)光源，優(yōu)點(diǎn)是得到很高的分辨率，記錄鈣離子三維空間分布；雙光子熒光顯微鏡則采用紅外激光作為光源，具有很高空間分辨率，而且背景噪聲比較低。

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